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北京恒奧德儀器儀表有限公司
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恒奧德儀器紫外分光光度計(jì)儀器組成 測(cè)定方法
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恒奧德儀器紫外分光光度計(jì)儀器組成 測(cè)定方法

 

儀器組成

分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成。

光譜范圍

包括波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200400 nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其*的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。

分光光度計(jì)圖片

分光光度計(jì)圖片(4)

鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400760nm波長(zhǎng)的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙,黃綠,藍(lán)靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計(jì)的光源。

氫燈(或氘燈)的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185400 nm波長(zhǎng)的光譜可作為紫外光光度計(jì)的光源。

 

蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)

這種方法是在280nm波長(zhǎng),直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過程非常簡(jiǎn)單,測(cè)試空白液,然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在些雜質(zhì),般要消除320nm 背景"信息,設(shè)定此能"。與測(cè)試核酸類似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí),發(fā)現(xiàn)讀數(shù)漂移"。這是個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上,只要觀察A280的吸光值的變化范圍不過1%,表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)?span>Warburg 公式吸光值換算成濃度,乘以定的系數(shù),只要吸光值有少許改變,濃度就會(huì)被放大,從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較。

比色法蛋白質(zhì)定量

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物,比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

測(cè)定方法

比色方法

般有BCA,BradfordLowry 等幾種方法。

Lowry 法:以早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),并有所改。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比,Lowry 法敏感性更。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng);容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA,Triton x-100ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

BCABicinchoninine acid assay)法:這是種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系較強(qiáng),反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于Lowry法,操作簡(jiǎn)單,敏感度。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

Bradford 法:這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其大的特點(diǎn)是,敏感度好,是Lowry BCA 兩種測(cè)試方法的2 倍;操作更簡(jiǎn)單,速度更快;只需要種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí),方便結(jié)果;而且與系列干擾Lowry,BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同樣品的結(jié)果差異較大,無(wú)可比性。


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