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恒奧德儀器HAD-V5YX 分光光度計原理操作方法
點(diǎn)擊次數(shù):1131      更新時間:2023-02-21


  HAD-V5YX 分光光度計原理操作方法

 

 

原理

分光光度計采用個可以產(chǎn)生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光線透過測試的樣品后,分光線被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

 

單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時,被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比,其關(guān)系如下式:

 

A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc

 

式中 :A 為吸光度;

 

I0為入射的單色光強(qiáng)度;

 

I 為透射的單色光強(qiáng)度;

 

T 為物質(zhì)的透射率;

 

k 為摩爾吸收系數(shù);

 

L 為被分析物質(zhì)的光程,即比色皿的邊長;

 

c 為物質(zhì)的濃度;

 

 

蛋白質(zhì)的直接定量UV法)

 

這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,測試空白液,然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在些雜質(zhì),般要消除320nm 背景"信息,設(shè)定此能"。與測試核酸類似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時,發(fā)現(xiàn)讀數(shù)漂移"。這是個正常的現(xiàn)象。事實(shí)上,只要觀察A280的吸光值的變化范圍不過1%,表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)?/span>Warburg 公式吸光值換算成濃度,乘以定的系數(shù),只要吸光值有少許改變,濃度就會被放大,從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較。

 

比色法蛋白質(zhì)定量

 

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物,比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

 

比色方法

 

般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。

 

Lowry 法:以早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),并有所改。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比,Lowry 法敏感性更。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA,Triton x-100ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

 

BCABicinchoninine acid assay)法:這是種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系較強(qiáng),反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法,操作簡單,敏感度。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

 

操作方法

1.接通電源,打開儀器開關(guān),掀開樣品室暗箱蓋,預(yù)熱10分鐘。

 

2.將靈敏度開關(guān)調(diào)至“1"檔(若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0"時,需選用較。)

 

3.根據(jù)所需波長轉(zhuǎn)動波長選擇鈕。

 

4.將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處,用擦鏡紙擦清外壁,放入樣品室內(nèi),使空白管對準(zhǔn)光路。

 

5.在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器,使讀數(shù)盤針向t=0處。

 

6.蓋上暗箱蓋,調(diào)節(jié)“100"調(diào)節(jié)器,使空白管的t=100,針穩(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿,分別讀出測定管的光密度值,并記錄。

 

7.比色畢,關(guān)上電源,取出比色皿洗凈,樣品室用軟布或軟紙擦凈。


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